Infraestrutura

Centro Regional de Hemoterapia – Hemocentro de Ribeirão Preto

Hospital das Clínicas – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP

Salas de Aula:

Sala Verde – (72 m²): unidade climatizada, composta de mesas modulares com cadeiras individuais, com capacidade para até 80 pessoas, equipada com sistema de multimídia e internet.

Sala Amarela – (22 m²): unidade climatizada, composta de carteiras individuais tipo escolar, com capacidade para até 30 pessoas, equipada com sistema portátil de multimídia.

Sala da Aula 1 Bloco F (33,93 m²) unidade climatizada, composta de carteiras individuais tipo escolar, com capacidade para até 16 pessoas, equipada com sistema portátil de multimídia.

Sala da Aula Bloco F (31,30 m²) unidade climatizada, composta de carteiras individuais tipo escolar, com capacidade para até 16 pessoas, equipada com sistema portátil de multimídia.

Anfiteatros:

Vermelho – (146 m²): unidade climatizada, composta de cadeiras individuais com braço escamoteável, com capacidade para 180 pessoas, equipada com sistema de multimídia, internet e som.

Azul – (62 m²): unidade climatizada, composta de cadeiras individuais com braço escamoteável, com capacidade para 50 pessoas, equipada com sistema de multimídia, internet e som.

Centro de Informática:

Centro de Informática (47 m²) Unidade Central de Informática, composta de por: 1)Servidor Central, com unidade de disco óptico para leitura e gravação, módulo de memória 16 DIMM, com duas unidades de disco rígido HP U320 SCSI 73 GB, 12 unidades de disco de 72,8 GB, uma unidade de fita magnética Ultrium 448, sistema operacional HPXV v1 – Modelo HP RP 4440; 2) Servidor PA-RISC série 9000, com 2 módulos de memória de 512 MB, com unidade de fita magnética Leasg 16-00, sistema operacional HP-UX V.11 – Modelo HP L2000; 3) Servidor PA-RISC série 9000, com unidade de disco de 2 GB, dois discos externos de 2 GB – Modelo HP K210/128; 4) Banco de Dados: a) Oracle 10G Database Standart, plataforma HP-UXPA-RISC; b) Sistema “Progress”; 5) 2 Servidores com memória de 1024 MB, unidade de disco de 72 GB, fonte de alimentação redundante – Modelo HP DL 380; 6) Sistema de rede Hub empilhável – Modelo 3 COM Super Stack; 7) No-Break, potencia nominal de 10 KVA automático; microcomputadores, scaner’s e impressoras, dentre outros.

Laboratórios:

Laboratório de Criobiologia I – (71 m²): unidade composta de áreas de apoio, de congelamento de células precursoras hematopoéticas e de estoque (sangue de cordão umbilical). Conta com os seguintes equipamentos básicos: aparelho conexão estéril, microcomputador, pipetas, câmara de conservação com acessório do embryo freezer para armazenagem de bolsas, sistema de estocagem-cryoplus, selador manual dielétrico com selador hemoseal automático de bancada para bolsa de sangue, capela de fluxo, contador automático de células, freezer horizontal, freezer ultra baixa temperatura (- 86ºC), cilindro de alta pressão capacidade de 25Kg, sistema para produção de água tipo 1, incubadora de CO2, phmetro portátil, microscópio invertido e óptico, termo hidrômetro, botijão criogênico para transporte, câmara de conservação, balança analítica, extrator de plasma, seladora universal frezenius, sistema “bioarchive” de armazenamento, centrifuga refrigeradora e de baixa velocidade e balança de precisão, dentre outros.

Laboratório de Transferência Genica – (41 m²): unidade composta de área laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microscópios invertido, monitores colorido, micro pipetador, pipetas de precisão, cuba de eletroforese, bomba à vácuo, sistema de eletreforese automatizado, refrigerador, capelas de segurança biológica, centrífugas, incubadoras, impressora, estabilizador, scanner de mesa colorido, freezer, rotor de angulo, câmara de vídeo digital, refrigerador duplex, agitador magnético, termociclador automático, phmetro, incubadora, agitador biológico, sistema de filtração avançado, frigobar, microcomputadores e impressoras, dentre outras.

Laboratório de Controle de Qualidade: (44 m²): unidade composta de área laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: coagunômetro, pipetas automáticas de precisão, refrigeradores, microscópios, phmetros, banhos-maria, freezer, centrífugas, espectofotômetro, capela de fluxo laminar, dentre outros.

Laboratório de H.L.A. – (22 m²): unidade composta de área laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: termociclador, citômetro de fluxo, plataforma, bomba de alimentação, microscópio, banho maria, centrifuga, pipetas, câmera fotográfica, cuba de eletroforese, balança, agitador de tubos, freezer refrigeradores, capela de biossegurança, incubadora, sistema de eletroforese,microcomputador com impressora.

Laboratório de Cultura Celular – (68 m²): unidade composta de área para cultura e laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microscópio óptico binocular, cilindro de CO2, pipetas de precisão, pipetador, freezer vertical (-86°), microscópio invertido com contraste de fase, agitador de tubos, incubadora, banho-maria, centrifuga refrigerada, sistema semi-automático de foto-micrografia, tanque nitrogênio liquido, capela de segurança biológica, microscópio biológico binocular, phmetro, refrigeradores, microscópio invertido, balança analítica, destilador de água, sistema de eletroforese, leitores de código de barras, capela de fluxo laminar, dentre outros.

Laboratório de Biologia Molecular: (94 m²): unidade composta de área laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: fonte eletroforese, destilador de água, banho maria, video copy processor, homogeneizador de microplacas, pipetas, compressor aspirador, sistema aquisição de imagem microscópica, unidade transluminadora para detecção fluorescência DNA, capela de fluxo laminar, incubadora, centrífugas, refrigerador duplex, termocicladores automático, concentrador de amostras, freezer, espectrofotometro para ácidos nucleicos, speed vac com componentes de alta capacidade, microcomputadores e impressoras, dentre outros.

Laboratório de Biologia Celular: (67 m²): unidade composta de área laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: refrigeradores, sistema eletroforese, impressoras, pipetas, cubas, espectrofotômetro, cellmax pump station, contador de cintilações e microplacas, freezer, centrífugas, microscópio biológico, banho maria, capela de exaustão, microcomputadores e impressoras, dentre outros.
Laboratório de Citometria de Fluxo: (47 m²): unidade composta de área laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: citômetro de fluxo, pipetas, refrigeradores, bomba de vácuo, sistema facstation power macintosh, facsorting interface, micropipetas, centrífugas, microcomputadores, impressoras, dentre outros.

Laboratório de Genética Molecular: (47 m²): unidade composta de área laboratorial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: projetor multimídia, termociclador automático, freezer, câmara para PCR, pipetas, refrigeradores, sistema de eletroforese horizontal, banho maria, microcentrífuga, agitador magnéticos, sequenciador, seladoras de placas, estufa de cultura bacteriológica, analisador genético de DNA, aparelho mults creem mini protean, sistema de micro placas, sonicador, carregador de gel, incubadora, sequenciador automático, capela de fluxo laminar, scanner HP Scanjet, micropipetas, termomixer digital, microcomputadores, notebook e impressoras, dentre outros.

Laboratório de Bio-informática: (25 m²): unidade composta de área de informática. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microcomputadores com monitores coloridos, scanner’s de mesa, impressoras e projetor de multimídia, dentre outros.

Laboratório de Pesquisas e Estudos: (34 m²): unidade composta de área de pesquisa por informática. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microcomputadores, impressoras, dentre outros.

CTC Biblioteca – (42 m²): a unidade conta com o acervo composto por 2024 livros, 4.000 periódicos e revistas, 19 obras de referência (impressas e CR-Rom), teses, dissertações e monografias, guias,11 assinaturas eletrônicas, 02 assinaturas de jornais, anais e coleção da produção científica do corpo docente, dentre outros.

Recursos Audio-visuais – (33 m²) – unidade composta de áreas para elaboração e produção de material bibliográfico e de imagens e multimídia. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microcomputadores, scanner’s de mesa, impressoras, plotter, filmadoras, câmaras fotográficas, equipamentos gravação de CD’s e DVD’s e projetores portáteis, dentre outros.

Serviços de Enfermagem – (76 m²) – unidade composta de áreas destinadas a gestão de enfermagem, apoio administrativo, aféreses, sala de transfusão, consultórios médicos, triagem de doadores e coleta de sangue. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microcomputadores, impressoras, esfignomanometros, sistemas para aférese, seladoras de bolsa, cadeiras para aférese, bombas de infusão, carrinhos de urgência e aspiradores cirúrgicos, dentre outros.

Serviço Social – (21 m²) – unidade composta de áreas destinadas ao apoio social a doadores e pacientes em regime ambulatórial. Conta com os seguintes equipamentos básicos: microcomputadores, impressoras, scanner, filmadora, câmara fotográfica, TV e equipamento de DVD, dentre outros.

Laboratório de Hematologia – (622 m2): unidade composta de área para secretaria, laboratório e cultura celular. Conta com os seguintes equipamentos básicos: geladeiras, freezer –20 e – 80 C, centrífugas com e sem refrigeração, centrífuga speed-vac, citocentrífuga, forno microondas, forno de hibridização, forno de hibridização para lâminas de microarrays, balança de precisão, pHmetro, geneQuant, espectrofotômetro, máquina de gêlo, máquina para congelamento de células, incubadora refrigerada de bancada, incubadora de bancada, termociclador, sistema de PCR em tempo real, banho-seco, banho-maria, sistema de purificação de água, capela de fluxo laminar, rack isolador negativo, incubadora de CO2, agitador de bandeja, agitador de tubos, agitador magnético com e sem aquecimento, fontes de alimentação para cubas de eletroforese, cubas de eletroforese vertical e horizontal, homogeneizador de tecidos, , scanner, sistema de documentação fotográfica, autoclave, contador/analisador celular, pipetadores, computadores e impressoras.

Biocentro – (881,79 m²) – unidade composta de áreas destinadas à laboratórios de HLA, Biotecnologia e anemias hereditárias, Terapia Celular, Citogenética e Imunofluorescência, Casa da Ciência e salas de apoio.

Laboratório de Biotecnologia e anemias hereditárias – Conta com os seguintes equipamentos básicos: microondas, agitadores, banho-maria, estufa e balança analítica.

Laboratório Terapia Celular (296,83 m²) – Conta com os seguintes equipamentos básicos: microscópio, pipetadores, centrífugas refrigeradas, freezer, banho-maria, contadores de células, incubadora de CO2, tanque de nitrogênio, cubas de eletroforese, capela de exaustão externa, phmetro, balança analítica, fonte de eletroforese e ultrafreezer.

Laboratório Citogenética e Imunofluorescência (86,24 m²) – Conta com os seguintes equipamentos básicos: microscópio, fonte de fluorescência, estufa para cultura, capela de exaustão, agitadores de tubos, contador de células.

Casa da Ciência e Museu e Laboratório de Ensino de Ciências – unidade composta de áreas destinadas a atividades educacionais. Conta com os seguintes equipamentos básicos: computadores, impressoras, plotter, scanner, DVD, vídeo cassete, filmadora, câmeras fotográficas, projetores multimídia, televisores, microscópio, quadro eletrônico, equipamentos de som, notebook, refrigerador.

Laboratório de Estudos Animais 1.587,47 m² – O Laboratório de Estudos Experimentais em Animais (LEEA) tem que compreende uma área destinada à produção de roedores para pesquisa científica composta de uma grande sala com 3 racks duplas de pressão positiva (Tecniplast) para manutenção de casais de camundongos, perfazendo um total de 13 linhagens, compostas de animais nocautes, transgênicos e mutantes espontâneos e duas estações de troca da marca Tecniplast. Ainda na área de barreira sanitária há mais 4 salas, sendo uma sala destinada à quarentena para animais recém-chegados na instituição (com uma rack dupla de pressão positiva marca Alesco), sala de criopreservação de embriões murinos dotada de um estereomicroscópio, um microforge e uma estufa de CO2, sala de manipulação de embriões murinos (transgenia) com microscópio invertido e dois micromanipuladores e uma sala reservada para criação de ratos.O LEEA compreende ainda uma área destinada à experimentação, composta de 4 salas, sendo uma delas local de manutenção dos animais em experimentação, onde há duas racks Alesco e um fluxo de troca de gaiolas (Veco), um refrigerador e 2 estantes em aço.Outra sala é destinada à realização dos protocolos experimentais dotada de 3 cabines de segurança biológica, 2 centrífugas refrigeradas, 1 aparelho de anestesia inalatória para camundongos, 2 câmaras de eutanásia (CO2), balança semi-analítica, banho-maria, vórtex, dois refrigeradores, uma equipamento de leitura in vivo de bio e quimioluminescência (IVIS), além de uma estufa simples e uma autoclave odontológica.As outras duas salas estão sendo equipadas para atuarem como sala de cultura e laboratório de imagem.A área de higiene e esterilização conta com sistema de esterilização de vapor/pressão com duas autoclaves horizontais de 570 litros cada, tanque de imersão e tanque de lavagem e desinfecção e ainda um equipamento de osmose reversa e um sonicador (para limpeza dos bicos dos bebedouros).Os outros ambientes são destinados ao condicionamento de sacos de ração e maravalha e outros produtos e material de uso na rotina do LEEA.O prédio conta com estrutura de banheiros (convencional e para pessoas com deficiência) além de uma copa, recepção e sala de freezeres (1 freezer -80C, 2 freezeres horizontais, 1 Crioplus 4).

Centro Químico de Proteínas – (460 m²) – unidade composta de áreas destinadas a laboratóros de preparação de amostras, eletroforese, secretaria, salas de apoio. Conta com os seguintes equipamentos básicos: agitador de tubos, agitador magnético, fonte de eletroforese, refrigerador, hypercassete, mocho odontológico, phmetro, sistema de avaliação de eletroforese, sistema de produção de água ultrapura e pré-tratamento de água.

Facilities

Durante a vigência do antigo INCT-2008 várias facilities foram consolidadas e hoje nosso grupo conta com 11 facilties para a realização das atividades de pesquisa (Infraestrutura).

Abaixo encontram-se as principais metodologias que serão utilizadas por nosso grupo.

Next Generation Sequencing (NGS): para investigar as alterações genéticas e epigenéticas. As assinaturas epigenômicas serão obtidas por sequenciamento em larga escala ou de nova geração. As células ou tecidos serão submetidos a extração de DNA e RNA pelo kit AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (QIAGEN). As bibliotecas de RNA-seq serão elaboradas com o kit TrueSeqTM RNA Sample Prep Kit v2 – Set A (Illumina, San Diego, CA, EUA; as bibliotecas de ATAC-seq serão preparadas com o kit Illumina Nextera (Illumina); e as bibliotecas de Metil-seq serão preparadas com o kit SureSelect Methyl-Seq (Agilent Technologies). Todas as bibliotecas serão sequenciadas nos equipamentos disponíveis em nossa Instituição.

Resumidamente,  análise de dados gerados será dividida em três partes: 1. controle de qualidade / filtro 2. identificação de regiões estatisticamente significantes de interesse 3. integração com os dados disponíveis publicamente, como o ENCODE, NIH Roadmap e TCGA. Cada passo da análise será realizada utilizando um computador de alta performance com o sistema Linux. Ressaltamos que nosso grupo possui experiência com análise de dados gerados por sequenciamento em larga escala em câncer  e está, atualmente, desenvolvendo uma nova ferramenta de bioinformática, nomeada de biOMICS (Biologically Integrating Omics), que tem o objetivo de integrar informações dos projetos: ENCODE, NIH Roadmap e The Cancer Genome Atlas (TCGA), com novos dados de sequenciamento em larga escala.

High Content Screening (HCS): emergiu recentemente como uma ferramenta poderosa no screening funcional de bibliotecas genômicas. Os métodos de HCS se baseiam na automatização dos processos de aquisição de imagens de microscopia de fluorescência de células dispostas em placas (de 96 ou 384 poços), bem como, do processamento e análise computacional das imagens; permitindo a avaliação qualitativa e quantitativa de um grande número de parâmetros morfométricos e condições experimentais. Recentemente, nosso grupo adquiriu um equipamento de HCS, com a finalidade de estudar o papel dos microRNAs na manutenção do estado pluripotente e na diferenciação de células tronco.

Citometria de Fluxo: Através da técnica de citometria de fluxo podemos avaliar a viabilidade celular, caracterizar populações celulares marcadas com anticorpos específicos. Trata-se de uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar células. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente (multiparamétrica).

Cultivo de células: o cultivo será realizado de acordo com as características de cada tipo celular, com meio de cultura específicos. As células serão mantidas em incubadoras Steri-cult 200 (Forma Scientific – Thermoforma) com 85% de umidade relativa, temperatura de 37ºC e 5% de CO2. As linhagens celulares serão criopreservadas em SFB contendo 10 % de DMSO e mantidos em nitrogênio líquido. Algums métodos analíticos que vamos utilizar para monitorar nossa cultura celular:

Análise de concentração celular e viabilidade. Para a análise de viabilidade e concentração de células será utilizado o método de exclusão o corante trypan blue com hemacitômetro.

Análise de substratos e metabólitos: Glicose, lactato e amônia serão determinados utilizando Biolyser Analyser (Kodak) após centrifugação da amostra a 200g por 5 minutos para retirada de células. A concentração de aminoácidos será analisada pelo sistema AccQ.Tag utilizando coluna de HPLC.

Flow-FISH: uma técnica que combina a hibridização fluorescente in situ com a citometria de fluxo e a instabilidade genômica avaliada por SNP-array. Esta é uma técnica de citogenética que será utilizada pelo nosso grupo para quantificar o número de cópias de elementos repetitivos específicos no DNA genômico de populações de células inteiras por meio da combinação de citometria de fluxo com fluorescência em protocolos de coloração de hibridação in situ. Flow-FISH é mais comumente utilizado para quantificar o comprimento dos telômeros, que são trechos de DNA repetitivo (repete TTAGGG hexaméricas) nas extremidades distais dos cromossomos nas células brancas do sangue, e um método semi-automático para fazê-lo foi recentemente publicado no comprimento natureza Protocols.

Análise da Expressão Gênica por PCR em Tempo Real.

A expressão dos genes será avaliada pelo método de PCR em tempo real. A análise quantitativa da expressão será realizada pela metodologia TaqMan (Applied Biosystems), cujos primers e sondas serão adquiridos pelo sistema AssayOnDemand. Para a normalização das amostras será utilizada a média geométrica dos Cts dos genes endógenos, GAPDH e b-actina, obtidos pelo sistema PDAR (Applied Biosystems) cuja eficiência de amplificação é a mesma dos genes alvos, o que possibilitou a análise pela metodologia de 10000/2^DC, fórmula esta que não necessita de gene calibrador para a análise.

Reprogramação celular com o uso de vetores lentivirais e epissomais.

As células iPS serão obtidas com o uso de um sistema plasmidial EBNA1/OriP aperfeiçoado contendo 5 fatores de reprogramação (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc e Lin28) na mesma molécula separados por sequências 2A, denominado pEB-C5 (Addgene).  Como controle da reprogramação, as iPSC serão geradas também utilizando um vetor lentiviral. Os vetores utilizados para inserção dos 4FT serão: o vetor lentiviral policistrônico cre-excisable EF1α-hSTEMCCA-LoxP, 3 vetores que codificam para as proteínas do capsídeo Gag-Pol, Rev e Tat (HDM-Hgpm2, RC-CMV-REV e HDM-TAT) e o vetor para o envelope viral HDM-VSV-G, que codifica para a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular. Além disso, será avaliado se somente as mudanças no ambiente da célula podem ser suficientes para que a reprogramação ocorra. Dessa forma, serão utilizadas as mesmas condições de cultura, sem a introdução de material genético. As linhagens de iPS serão estabelecidas de acordo com protocolos descritos na literatura com algumas variações. Colônias com morfologia semelhante às CTE humanas serão isoladas, expandidas e avaliadas quanto suas características pluripotentes e potencial de diferenciação.

Produção de vetores virais

Células 293T são frequentemente utilizadas para a produção de partículas lentivirais. Para a produção viral é importante que a linhagem celular (293T) expresse estavelmente o gene para o grande antígeno T do SV40. Neste método é necessário o uso de um vetor contendo o transgene e dois vetores auxiliares, que possuam a origem de replicação do SV40, para que após a transfecção os plasmídeos dentro das células possam de replicar, o que aumenta a transcrição do transgene e a produção de proteínas virais e por fim mais partículas virais serão secretadas no meio de cultura.

Cultura e diferenciação das células pluripotentes

Linhagens de células pluripotentes mantidas em cultura em estado indiferenciado serão cultivadas em placas de 100mm³ tratadas com gelatina 0,1% e cobertas com células OP9 de estroma de camundongo em meio Minimum Essential Medium Alpha Medium (α-MEM), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), monoatilcilglicerol 100µM (Roche Diagnostics) durante nove dias, trocando metade do meio das placas de cultura nos dias 4 e 6 sem adicionar citocinas. Após os nove dias, as células serão recolhidas das placas. Para isso, elas serão tratadas com enzima tripsina-EDTA (0,5%) (Mediatech), por 10 minutos a 37ºC, recolhidas em tubo cônico e centrifugadas a 1300 rpm por 10 minutos. O sobrenadante será descartado e o pellet de células formado será tratado novamente com enzima tripsina-EDTA (0,25%) por 15 minutos para individualizar as células. Após esse tempo, as células individualizadas serão centrifugadas a 1300 rpm por 10 minutos, ressuspensas em meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12) (Sigma) e contadas em câmara de Neubauer.

O repique de colônias de células-tronco pluripotentes se dará por meio da transferência de fragmentos de colônias para uma nova placa. Será utilizado o repique manual de colônias, utilizando-se uma capela biológica de fluxo laminar horizontal contendo um microscópio invertido. Após a substituição do meio de cultura por meio fresco, e observando-se em microscópio, as colônias serão fragmentadas, com auxílio de uma ponteira estéril em tamanhos menores. Em seguida, o sobrenadante contendo os fragmentos de colônias suspensos será diluído para a densidade desejada e transferido para novas placas. A individualização de células pluripotentes não é desejada, pois favorece a morte ou diferenciação celular.

As colônias de células pluripotentes (hESC e hiPS) serão caracterizadas por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência utilizando-se anticorpos contra os seguintes antígenos: SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-80, NANOG, SOX2 e OCT4. Também serão avaliados a atividade de fosfatase alcalina e o cariótipo através de bandeamento G, de acordo com protocolos descritos na literatura.

Diferenciação em corpos embrioides

Para formação de corpos embrióides (CE), as colônias de células pluripotentes (hESC e hiPS) serão digeridas com dispase (0,5 mg/mL) por 10 minutos e os grumos serão cultivados em suspensão em placas de baixa aderência, em meio DMEM 10% SFB. Nesta condição de cultivo, as células pluripotentes tendem a se diferenciar espontaneamente. Essas amostras serão utilizadas para caracterização imunohistoquímica e para a extração de DNA e RNA.

Extração de DNA, RNA e microRNA

Utilizaremos o kit AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (QIAGEN) para a extração de DNA, RNA e microRNA das amostras, seguindo as instruções do fabricante. O princípio do kit consiste em integrar a tecnologia do isolamento de DNA dupla fita por ligação específica com a tecnologia RNeasy de extração de RNA.  As amostras biológicas serão primeiramente lisadas e homogeneizadas em um tampão de isotiocianato de guanidina de alta desnaturação, que inativa DNases e RNases para garantir o isolamento de DNA e RNA íntegros. O lisado será passado pela coluna AllPrep DNA Mini spin, que em combinação com um tampão com alta concentração de sal, permite a ligação eficiente e seletiva de DNA genômico. Em seguida, a coluna será lavada e será eluído o DNA puro e pronto para o uso. O eluído da lavagem da coluna AllPrep DNA Mini spin será digerido por proteinase K na presença de etanol. Essa digestão otimizada e a subsequente adição de etanol permite a ligação eficiente do RNA total, incluindo microRNA, na coluna RNeasy Mini spin. A digestão com DNase I garante altas concentrações de RNA livre de DNA. Os contaminantes são eficientemente removidos e será eluído RNA de alta qualidade.

Análise da integridade do RNA

A qualidade do RNA extraído será analisada pelo equipamento Bioanalizer 2100 (Agilent Technologies) da seguinte forma: 1) o RNA extraído será quantificado por espectrofotometria (NanoDrop, Thermo Scientific) e diluído para a concentração de 5ng/µL. Após a diluição, a amostra será desnaturada por incubação a 70ºC por 2 minutos e imediatamente colocado no gelo. 2) as amostras serão aplicadas no chip kit Eukaryote RNA Total Pico (Agilent), seguindo as instruções do fabricante para preparação do chip. 3) Em seguida, o chip será colocado no aparelho Bioanalizer 2100 para a análise. 4) Após a corrida, serão gerados os valores de RIN (RNA integrity number) e o gel correspondente para cada amostra.

Expansão em larga-escala de linfócitos T e células NK.

Células T e NK adequadamente isoladas serão inoculadas na concentração de 1×106 cel/mL em bolsas de cultura permeáveis (VueLife) contendo o meio de cultura previamente aquecido. Uma vez atingido o número adequado de células, as mesmas serão transferidas para as bolsas do Biorreator Wave (aproximadamente 1×108 células para bolsas de 2L e 2×108 células para bolsas de 10L). As culturas serão realizadas em perfusão.

Universidade de São Paulo

Instituto de Biociências / Departamento de Genética e Biologia Evolutiva