Recentemente, testemunhamos uma modificação essencial no entendimento da biologia do câncer que trouxe profundas implicações na sua terapia. Até o final do século passado, a visão prevalente era a de que qualquer célula somática ou germinativa, alvo de alterações genéticas cumulativas, poderia originar o câncer. Esta visão foi substituída pelo conceito de que o câncer somente se inicia por um contingente restrito de células, as chamadas células-tronco tumorais (CTT). Estas CTTs possuem características específicas que facilitam o seu isolamento e caracterização: a) são as únicas células capazes de originar o tumor; b) possuem capacidade de auto-renovação, ou seja, de manter o tumor; c) originam toda a progênie celular heterogênea que constituí o tumor; d) quando transplantadas em camundongos imunodeficientes, estas células – e somente elas – são capazes de recapitular o tumor original com todas as suas características morfológicas e funcionais (2).
Embora o conceito de CTT possa remontar a Rudolph Virchow no século XIX, a efetiva demonstração da sua existência somente apareceu em 1994 quando Lapidot e colaboradores demonstraram que apenas as células CD34+/CD38- na leucemia mieloide aguda eram capazes de reproduzir a leucemia em camundongos NOD/SCID, enquanto células CD34+/CD38+ não o eram. Desde então, CTTs foram demonstradas em diversos tipos de tumores como o de mama, de próstata, de fígado, de cólon, de pulmão, de pele, de pâncreas e de cérebro.
Com a consolidação deste conceito, o desafio para o entendimento da biologia do câncer é isolar e caracterizar as CTTs e não mais todo o tumor. O mesmo se aplica ao tratamento, que somente é efetivo quando é capaz de erradicar as CTTs.
Os tumores, no seu conjunto, são massas heterogêneas de células neoplásicas e normais, associadas à matriz extra-celular de modo a constituir um microambiente propício para a manutenção e proliferação das CTTs e respectiva progênie. Entender a biologia do câncer, em nossa concepção, significa separar e analisar esses vários componentes com o objetivo de avaliar a contribuição específica de cada elemento para o conjunto.
Com base nestas considerações, propomos uma abordagem metodológica inovadora no nosso meio, qual seja as análises citômicas, genômicas e proteômicas de células individuais (single cell analysis) isoladas dos vários compartimentos tumorais (CT tumoral, células do estroma tumoral, células do sistema imune infiltrantes do tumor) além dos componentes da matriz tumoral.
Para atender esta proposta, planejamos um conjunto de subprojetos que resumidamente indicamos abaixo.
1.1 Isolamento, identificação e caracterização das Células-Tronco Tumorais
O isolamento das CTTs será feito por metologias clássicas, que incluem análises por citometria de fluxo (side population, efluxo de Hoechst 33342), a separação celular com base na expressão de moléculas de superfície e a capacidade de formação de esferas quando em cultura. Adicionalmente, estas CTTs serão separadas individualmente na plataforma C1™ Single-Cell Auto Prep System (Fluidigm Corporation) para subsequente preparação de bibliotecas de RNA-Seq, e exomas correspondentes a 96 células individuais provindas da população selecionada.
No Subprojeto 1 intitulado “Análise da heterogeneidade genética das células tumorais: identificação e caracterização funcional de biomarcadores para fins terapêuticos em câncer”, coordenado pelo Prof. Wilson Araújo Silva Júnior, pretende-se, além da análise de alterações genéticas e epigenéticas obtidas por sequenciamento de nova geração(NGS), estudar os RNAs não-codificadores que têm papel na regulação de processos oncogênicos. Os RNAs não-codificadores, pequenos (miRNAs, piRNAs), médios (PASRs) ou longos (do inglês, long non-coding RNAs – lncRNAs) regulam diversos processos moleculares, genéticos e celulares ligados à progressão tumoral, que incluem: compensação da dosagem cromossômica, modificação da estrutura da cromatina, transcrição e tradução, splicing, diferenciação celular, manutenção da integridade de estruturas celulares, controle do ciclo celular e do tráfego intracelular, reprogramação de células-tronco e resposta ao heat-shock. Esta estratégia será usada para identificar novos RNAs não-codificadores em tumores agressivos como melanoma, glioblastoma multiforme e câncer gástrico que possam ser aplicados ao diagnóstico e prognóstico do câncer, assim como servir como novos alvos terapêuticos
Uma segunda abordagem metodológica, inovadora entre nós, será o emprego do High Content Screening (HCS) para a avaliação funcional das subpopulações de CTTs isoladas como referido anteriormente. O HCS é um processo automatizado de aquisição e análise computacional de imagens de microscopia de fluorescência em células dispostas em placas que permite a avaliação qualitativa e quantitativa de um grande número de parâmetros morfológicos e funcionais. Assim, é possível a realização de análises funcionais em larga escala. No Subprojeto 2 “Análise funcional em grande escala para a identificação de microRNAs com potencial antitumoral e antimetastático no câncer de cabeça e pescoço”, coordenado pelo Prof. Marco Antonio Zago, serão idetificados os microRNAs ou anti-miRs com atividade anti-proliferativa, pró-apoptótica e anti-metastática envolvidos nos processos de Transição Epitélio-Mesenquimal (EMT) ou no processo reverso Transição Mesenquimal-Epitelial (MET) que possam ser utilizados no desenvolvimento de novas abordagens terapêutico para o tratamento dos carcinomas em geral.
Em estudos anteriores de genômica funcional de tumores de cabeça e pescoço, nosso grupo (Processo 559809/2009-3 – Rede GENOPROT, coordenado pelo Prof. Wilson Araújo da Silva Júnior) identificou vários microRNAs e mRNAs com a expressão alterada e possivelmente implicados na patogênese destas neoplasias, constituindo-se em potenciais alvos terapêuticos.
Na mesma linha, pretendemos no Subprojeto 3 “Identificação e caracterização das células-tronco neoplásicas em câncer de próstata“, coordenado pelo Prof. Dimas Tadeu Covas, quantificar e caracterizar as CTTs no câncer de próstata, que é segunda causa de mortalidade por neoplasias em homens. Amostras de tumores em diferentes estágios de progressão e agressividade serão coletadas para caracterização das CTTs empregando algumas das metodologias já citadas. A hipótese a ser testada é que o número de CTTs e suas características biológicas e funcionais se correlacionem com a gravidade da doença e com seu poder metastático. As CTTs serão isoladas por separação celular e analisadas em células isoladas com relação ao seu citoma e exoma; na sequência, serão cultivadas, caracterizadas novamente e implantadas em camundongos NOD/SCID para estudos de reconstituição tumoral.
Com relação ainda à caracterização das propriedades biológicas das células tumorais, propomos também o Subprojeto 4 “Estudo a expressão do HLA-G e outras moléculas imunorregulatórias em tumores selecionados” coordenado pelo Prof. Eduardo A. Donadi. Genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) estão diretamente envolvidos na imunovigilância, evitando o desenvolvimento e progressão de neoplasias. Em humanos, o complexo é conhecido como sistema de Antígenos Leucocitários Humanos (HLA). O gene HLA-G é um loco HLA de classe I não clássico e seu polimorfismo e padrão de expressão vêm sendo estudados em diversas condições patológicas, incluindo tumores. As células tumorais buscam desenvolver mecanismos de evasão da resposta imunitária. Vários estudos demonstraram que as moléculas HLA-G podem ser expressas de forma aberrante em células tumorais, e que esta expressão pode estar associada a um possível papel no escape da imunovigilância por inibição da ação de células Natural Killer e T citotóxicas. Entretanto, a maioria dos aspectos relacionados ao mecanismo de expressão do gene HLA-G permanece ainda desconhecida. A região promotora do gene HLA-G é altamente polimórfica, sendo identificados 28 SNPs que se organizam em haplótipos e podem estar relacionados a atividades promotoras distintas, resultando em alta ou baixa expressão de HLA-G. A avaliação dos polimorfismos da região promotora em tumores é um componente fundamental na elucidação dos mecanismos de expressão de HLA-G, uma vez demonstrado que HLA-G apresenta propriedades imunossupressoras e sua expressão está associada a uma grande variedade de neoplasias. A hipótese de que SNPs encontrados na região promotora do gene HLA-G influenciam sua expressão e dessa forma, a susceptibilidade e progressão de tumores. Esses dados permitirão avaliar a aplicabilidade de polimorfismos do gene HLA-G como base de testes preditivos relacionados ao prognóstico desses tumores. O grupo propõe realizar a tipificação do gene completo (região promotora, codificadora e 3´ não- traduzida) de moléculas de histocompatibilidade clássicas (HLA- A, B e C) e não-clássicas (E, F e G), e análise da expressão de moléculas imunorreguladoras (HLA-G, PD-1, CTLA-4) em sarcomas, melanoma grau IV ou linfomas, antes e após tratamento quimioterápico associado a hipertermia e imunoterapia.
No estudo das células tumorais nas neoplasias mieloides, o Subprojeto 5 “Dinâmica telomérica e instabilidade genômica na célula tumoral da mielodisplasia“, coordenado pelo Prof. Rodrigo T. Calado, tem como objetivo estudar a dinâmica telomérica e a instabilidade genômica na célula tumoral da mielodisplasia. Este subprojeto tem por objetivo avaliar o efeito do encurtamento telomérico na instabilidade genômica em células precursoras (CD34+) de pacientes com síndrome mielodisplásica (SMD). A SMD é uma neoplasia mieloide caracaterizada por hematopoese ineficaz, citopenias no sangue periférico e evolução para leucemia mieloide aguda. Alterações na célula tumoral são características da SMD, em especial alterações citogenéticas e mutações. O encurtamento telomérico é o evento molecular principal da fisiopatologia de algumas síndromes de falência medular que podem evoluir para SMD. As células CD34+CD38– serão obtidas por separação celular (JSAN flow cytometer) a partir da medula óssea de pacientes com o diagnóstico de SMD. O comprimento telomérico será determinado por flow-FISH, uma técnica que combina a hibridização fluorescente in situ com a citometria de fluxo e a instabilidade genômica avaliada por SNP-array.
1.2. Microambiente tumoral
As células tumorais são imprescindíveis para a iniciação e progressão neoplásica, mas são incapazes de fazê-lo isoladamente. Um repertório diversificado de células não-tumorigênicas (e.g. fibroblastos, macrófagos, células endoteliais) é recrutado de sítios circunjacentes e/ou distantes para constituir o estroma do microambiente tumoral. Estas células recrutadas, juntamente com a matriz extracelular, são capazes de prover as principais características do câncer, como o escape da vigilância imunológica, ativação da angiogênese, invasão e metástase, além de dar suporte à resistência terapêutica. Portanto, a compreensão do papel do estroma tumoral e sua comunicação com as células neoplásicas pode levar à identificação de alvos na terapia anti-neoplásica.
Dentre os componentes celulares do estroma tumoral, nosso interesse recai em macrófagos e fibroblastos associados ao tumor (TAMs e TAFs, respectivamente). Em resposta às citocinas presentes no microambiente tumoral, os TAMs passam por um processo de polarização, assumindo um fenótipo imunossupressor denominado M2. Além de contribuir para a evasão da vigilância imunológica por meio deste mecanismo, moléculas secretadas pelos TAMs promovem a proliferação das células tumorais, a angiogênese, linfangiogênese e metástase. Portanto, pretendemos estudar o papel dos TAMs no microambiente tumoral na leucemia promielocítica aguda e no melanoma no Subprojeto 6 “Macrófagos associados a tumor: isolamento, caracterização e estudo funcional em modelos animais” coordenado pelo Prof. Eduardo M. Rego. A primeira doença apresenta características genéticas, morfológicas e clínicas peculiares que são em grande parte reproduzidas no modelo murino transgênico hCG-PML-RARA, de tal sorte que este tornou-se um dos modelos mais usados para o estudo da leucemogênese. Além dos estudos no modelo transgênico murino, serão estudadas amostras de uma coorte de mais de 200 pacientes com leucemia promielocítica aguda que fazem parte do estudo do Consórcio Internacional em Leucemia Promielocítica Aguda, cuja base de dados contempla características ao diagnóstico, desfechos clínicos relevantes e monitoramento molecular da resposta a um tratamento comum.
Os TAFs consistem em uma população heterogênea de células fibroblásticas as quais sustentam virtualmente todas as propriedades do câncer. Notavelmente, postula-se que os TAFs facilitam os processos de invasão e colonização das células tumorais. Estas são duas etapas limitantes da metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Portanto, estudaremos o papel dos TAFs na invasão e colonização metastática de células de melanoma no Subprojeto 7 “Estudo do papel de fibroblastos associados ao tumor durante a invasão e colonização metastática de melanoma.”coordenado pelo Prof. Dimas T. Covas. O melanoma será usado como modelo, pois esta classe de neoplasias apresenta grande propensão à metástase e os subtipos não-invasivos, invasivos e metastáticos são facilmente identificáveis após inspeção clínica.
Ainda em doenças onco-hematológicas, o Subprojeto 8 “Investigação das vias de sinalização envolvidas na interação entre células-tronco hematopoéticas e células do nicho da medula óssea nas neoplasias mieloides”, coordenado pelo Prof. Roberto P. Falcão, tem como objetivo estudar a relação entre CTTs e seu nicho regulatório, interação esta que mantém a mieloproliferação descontrolada, com o intuito de identificar novos alvos terapêuticos que atinjam essa complexa interação em neoplasias mieloides mieloides e o microambiente tumoral. A classificação da OMS (Organização Mundial de Saúde) distingue quatro grupos de neoplasias mieloides: neoplasias mieloproliferativas crônicas (NMP), síndromes mielodisplásicas (SMD), NMP/SMD e leucemia mielóide aguda (LMA), cada qual com suas características específicas. As diferentes populações celulares serão isoladas por “sorting” com marcadores específicos; a CTT hematopoética será identificada como CD34+, a célula estromal mesenquimal (CEM) será identificada como CD45, CD34 e CD31 negativas e CD44, CD73, CD90 e CD105 positivas. Adicionalmente, realizaremos experimentos de co-cultura de células hematopoéticas primárias neoplásicas com CEMs obtidas de amostras de medula óssea normal, assim como co-cultura de células hematopoéticas primárias normais com CEM obtidas de pacientes com neoplasias mieloides. Após a co-cultura, as populações de CTH e CEM serão isoladas para análise proteômica, e as CTHs serão analisadas funcionalmente quanto à proliferação celular, apoptose e diferenciação in vitro e capacidade de reconstituição hematopoética in vivo por meio de xenotransplante. As amostras serão submetidas à análise proteômica por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas de alta resolução. Uma vez identificados, os alvos serão submetidos a analise funcional em linhagens celulares através de inibição farmacológica ou utilização de ferramentas da terapia gênica. Os alvos validados nas linhagens como sendo relevante para alterações fenotípicas serão submetidos a experimentos utilizando células primárias.
Outra população de células presentes no microambiente tumoral são os linfócitos T regulatórios (Tregs), que atuam de maneira fundamental no controle periférico da homeostase do sistema imune, estando envolvidas no controle de doenças autoimunes, na tolerância de transplantes, assim como, no escape imune de tumores (4, 5). O papel regulatório destas células confere-lhes potencial terapêutico, uma vez que sua administração poderia beneficiar pacientes com doenças autoimunes ou submetidos a transplantes e, por outro lado, a inibição de sua geração ou função poderia beneficiar pacientes portadores de tumores, permitindo a atuação do sistema imune contra as células tumorais (6). Assim, o entendimento dos processos responsáveis pela geração destas células, poderia contribuir para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas em ambos os sentidos. Neste sentido, no Subprojeto 9 “Estudo de mecanismos regulatórios envolvidos no processo de geração in vitro de células T regulatórias induzidas (iTreg) a partir de células T naïve”, coordenado pelo Prof. Marco Antonio Zago, propomos avaliar diferentes mecanismos de regulação durante o processo de indução e geração in vitro de linfócitos Tregs, incluindo a regulação transcricional mediada por diferentes subunidades de NF-kB (por ChIP-Seq), a regulação pós-transcricional mediada por microRNAs, e o papel da sinalização por adenosina e seus receptores.
Os componentes da matriz extracelular (ECM) também modulam circuitos moleculares nas células tumorais por meio da interação com receptores presentes na membrana plasmática. Sabe-se que em algumas neoplasias a ECM favorece a proliferação das células tumorais estimulando a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Assim, avaliaremos a constituição da ECM e seu efeito na produção de ROS em diferentes estágios de progressão de osteossarcoma. Além disso, estudaremos o efeito da imunoterapia e hipertermia na modulação da composição da ECM e na síntese de ROS em células isoladas de osteossarcomas em diferentes estágios de progressão no Subprojeto 10 “Avaliação da matriz extracelular e espécies reativas de oxigênio no microambiente tumoral”, coordenado por Maria Angélica Miglino.
1.3. Reconstituição tumoral
O câncer se origina de células-tronco tumorais (CTTs), um pequeno contingente de células com propriedades de auto-renovação e manutenção de toda a progênie de células maduras que compõem o tecido tumoral. Os processos que originam as CTTs não são totalmente conhecidos e duas principais hipóteses têm sido propostas: 1) As CTTs se originam de células-tronco normais que, devido à sua maior longevidade e consequente exposição a agentes que danificam o DNA, acumulam modificações gênicas e epigenéticas que terminam por originar as CTTs. As similaridades entre as CT normais e as CTTs encontradas em vários tipos de câncer reforçam esta hipótese (7-11); 2) A segunda hipótese postula que as células somáticas diferenciadas possam ser “desdiferenciadas”ou reprogramadas para adquirir, inicialmente, características metaplásicas ou neoplásicas. Esta hipótese tem o apoio de evidência experimental. Scaffidi e col. demonstraram que fibroblastos maduros podem ser induzidos in vitro a adquirir as características de CTT, incluindo a habilidade de auto-renovação e de diferenciação em várias linhagens. De forma semelhante, fibroblastos transduzidos com o antígeno SSEA1 podem originar e manter tumores e astrócitos normais do SNC transduzidos com ongenes podem originar gliomas. Esta segunda hipótese também tem suporte no fato de que células diferenciadas podem ser transformadas em células-tronco pluripotentes (12) pela inserção de genes de pluripotência ( Sox, Oct4, C-Myc e Klf4) que originam teratomas quando injetados em camundongos imunodeficientes.
Com o objetivo de explorar o processo de origem das CTTs, propomos utilizar a tecnologia de reprogramação celular em células tumorais no Subprojeto 11 “Reconstituição Tumoral a partir da reprogramação de células tumorais”,coordenado pelo prof. Dimas T. Covas. Uma pergunta que pretendemos responder é se a reprogramação gênica de células tumorais com genes de pluripotência (SOX, NANOG e OCT4) reverte o padrão epigenético anormal acumulado durante o desenvolvimento oncogênico. Para responder essa questão, o objetivo consiste em testar o protocolo de reprogramação clássico (OCT4, SOX2, KLF4 e MYC) em diferentes linhagens de células tumorais e avaliar: i) a aquisição de pluripotência, ii) a recapitulação da hierarquia de diferenciação celular, iii) a capacidade de reprogramação epigenética e iv) a possível reversão da tumorigenicidade.